ELISPOT Nedir, Nasıl Kullanılır?

ELISPOT: Antijene Özgü Bağışıklık Yanıtının En Hassas Ölçümü

ELISPOT (Enzyme-Linked ImmunoSpot), tek hücre düzeyinde sitokin salınan hücreleri sayan, hücresel bağışıklık yanıtlarının altın standart ölçüm yöntemidir. Aşı geliştirme, immünojenite ve T hücre yanıtı çalışmalarının merkezinde yer alır.

Yöntem Nasıl Çalışır?

1. ELISPOT plakası, ilgi sitokinine özgü çapraz bağlanmış antikorla kaplanır
2. Hücreler (PBMC veya izole lenfositler) peptit/protein antijen ile birlikte kuyucuklara ekilir
3. İnkübasyon sırasında (18-48 saat) antijene özgü aktive T hücreleri sitokin salar; salınan sitokin, hücrenin hemen yakınındaki membrana bağlanır
4. Biyotinli ikinci antikor ve enzim/substrat tepkimesiyle her sitokin salan hücre görünür bir spot üretir
5. Spotlar sayılır; sonuç SFC (spot-forming cell) / 10⁶ hücre olarak raporlanır

Neden ELISPOT?

• Aşırı hassasiyet: 100.000 hücre içindeki 20-30 antijene özgü hücreyi bile saptayabilir; intraselüler sitokin boyamasının (ICS) bile erişemediği düşük frekanslar ölçülür
• Kantitatif: Doğrudan hücre frekansı verir
• Küçük numune: Görece az hücre ile çalışır
• Regülatör geçmişi: Aşı çalışmalarında kabul görmüş, zengin literatür dayanağı olan bir endpoint

ICS ile Farkı ve Birlikteliği

ELISPOT kaç hücre yanıt verdiğini söyler; ICS (intraselüler sitokin boyama) hangi fenotipte olduğunu da ekler. Kapsamlı immünojenite çalışmalarında ikisi birlikte kullanılır: ELISPOT ile frekans, ICS ile phenotipik ve fonksiyonel derinlik kazanılır.

Dikkat Edilmesi Gerekenler

• Hücre kalitesi: Dondurulmuş-çözülmüş PBMC'lerde canlılık >%80 olmalıdır; ölü hücreler arka planı artırır
• Uygun kontroller: Negatif kontrol (stimülasyonsuz), pozitif kontrol (PMA/iomycin veya anti-CD3/CD28) ve varsa yükleyici kontrol (DMSO) zorunludur
• Spot okuma standardı: Otomatik okuyucu eşik ayarları çalışmaya göre valide edilmelidir
• Antijen seçimi: Peptit havuzu (overlap), rekombinant protein veya tam antijen; yanıt tipine (MHC I/II) göre belirlenir

Uygulama Alanları

• Aşı immünojenite: Aşı adayı sonrası T hücre yanıtı büyüklüğü
• Kanser immünoterapisi araştırma: Tümör antijene özgü T hücre frekansı
• Enfeksiyon modelleri: Patojene özgü hücresel yanıt kinetiği
• İlaç immunotoksisite: T hücre fonksiyon baskılanması değerlendirmesi

ELISPOT ve ICS analizlerimizi stimülasyon protokolü tasarımı, kontroller ve istatistiksel değerlendirme dahil sunuyoruz. Projeniz için teklif alabilirsiniz.